En un libro de cuentas del primer tercio del siglo XVIII encontramos la descripción más antigua que se conoce sobre el origen de la Hermandad. Casi con toda seguridad debió ser redactada bajo el mandato del prioste Antonio Ramos Mexía, impulsor de una de las etapas más florecientes, ya que impulsó la construcción del nuevo templo y fomentó el patrimonio material y espiritual de nuestra corporación.
Noticias de la Antigüedad de esta Hermandad de Nuestra Señora de la O

Supónese que los principios de esta hermandad fueron los de ser esta capilla y ermita el hospital de Santa Brígida y en la agregación que de los hospitales hizo el Ilmo. Sr. D. Pedro de Castro y Quiñones fue uno de los agregados este hospicio en cuyo tiempo los mismos hermanos y vecinos tomaron por titular la Imagen de Ntra. Sra. de la O en cuyo culto se emplearon fervorosos su regla y estatutos que son los que constan en la regla nueva que es la que hoy se usa y se dispone en la mesa que es copia de la regla antigua que en la inundación del año de mil seiscientos y ochenta y cuatro padeció esta calle y toda Triana la cual está en el archivo y por auto del Señor Provisor de este Arzobispado, el señor doctor Cebadilla y Francisco Aragonés su notario consta que el día diez de Agosto de Mil Quinientos y Sesenta y Seis años quedó la regla aprobada desde cuando se reconoce su Antigüedad, porque aunque desde la dicha agregación tuvo principios no consta de otra aprobación por cuanto en la inundación de Aguas que hubo en el año de Mil Seiscientos y Veinte y Seis padeció esta hermandad el barro de todos sus papeles= Con lo cual queda asentado lo cierto de la Antigüedad suya y que sin embargo de serlo tanto queda hoy en estado de que se estime por dilatados siglos para mayor gloria y honra de Dios Nuestro Señor y su Santísima Madre
El Hospital de Santa Brígida existía en los años finales de la Edad Media, el documento más antiguo que se conserva es de 1483, nueve años antes del descubrimiento de América. Se trata de un censo sobre unas casas que tenía la hermandad de Santa Brígida, propietaria del hospital.
En algún momento de la primera mitad del siglo XVI se asentó en el hospital la Hermandad de Santas Justa y Rufina, del gremio de olleros de Triana.

Simultáneamente, surgió entre los vecinos de ese sector norte de Triana la devoción a la Virgen María en el momento de la Expectación del Parto.
Finalmente, a mediados del siglo XVI y como consecuencia de la extensión de los principios del concilio de Trento, en especial el de la conveniencia de practicar la disciplina pública como muestra de arrepentimiento por los pecados y en conmemoración de la Pasión de Nuestro Señor Jesucristo, se fundó la cofradía de penitencia en 1566, donde se integraron los feligreses del hospital, tal y como se desprende del título que aparece en las Reglas de los honrados cofrades y hermanos de la cofradía y hermandad de Santa María de la O y nuestra Santa Brígida y de las Vírgenes Santa Justa y Rufina.